Хроматография на бумаге (БХ)

Впервые метод бумажной хроматографии применили для разделения и идентификации аминокислот в 1943 г. В зависимости от природы процесса разделения БХ принято классифицировать как распределительную, адсорбционную и ионообменную. Методика БХ

(как и тонкослойной хроматографии) проста и оперативна, что в сочетании с требуемыми микроколичествами анализируемых веществ объясняет широкое распространение метода.

При хроматографировании на бумаге разделение анализируемых веществ происходит в результате многократных актов адсорбции на целлюлозе бумаги (или абсорбции в воду, пропитывающей бумагу) - в неподвижной фазе и актов десорбции в элюирующий раствор - в подвижной фазе. Бумага должна быть однородной по плотности, химически и адсорбционно-нейтральной. В настоящее время промышленность России выпускает четыре сорта хроматографической бумаги № 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается по плотности, следовательно, и по скорости движения растворителя. Бумагу № 1 и 2 называют «быстрой», а № 3 и 4 - «медленной». Выпускают и специальные сорта бумаги с высоким содержанием карбоксильных групп (для разделения катионов), а также - бумаги, содержащие иониты или другие адсорбенты.

Этот процесс проходит следующим образом. На полоску хроматографической бумаги наносят каплю раствора, содержащую смесь веществ, и дают ей высохнуть. Далее один конец бумаги опускают в сосуд с подходящим растворителем и его плотно закрывают.

Растворитель, двигаясь под действием капиллярных сил вдоль полоски бумаги, захватывает компоненты анализируемой смеси. В результате процессов сорбции - десорбции происходит разделение смеси на отдельные компоненты. Так же как и в тонкослойной хроматографии, качество разделения зависит от величины коэффициентов распределения компонентов - R/, характеризующих относительную скорость их перемещения по бумаге. Для качественного разделения на бумаге значения R/ компонентов должны быть в пределах 0,05-0,85.

Методика проведения анализа на хроматографической бумаге аналогична методике тонкослойной хроматографии. Существует несколько ее вариантов: одномерная, двухмерная, круговая и электрофоретическая. Как и в тонкослойной хроматографии, метод одномерной и двухмерной хроматографии предполагает восходящие или нисходящие потоки растворителя.

Выбор подходящего растворителя - достаточно сложная задача. Этот компонент, так же как и анализируемые вещества не должны резко отличаться по полярности и гидрофильным свойствам, иначе они или останутся на линии старта, или будут двигаться вместе с фронтом растворителя. Если вещество исследуемой системы остается на стартовой линии, это свидетельствует о его малой растворимости в подвижной фазе, в этом случае следует применить более полярный растворитель. Если же, наоборот, вещество движется вместе с фронтом растворителя (/?/= 1), то это означает, что оно слабо взаимодействует с неподвижной фазой, и для анализа следует выбрать менее полярный растворитель. Для сильногидрофильных веществ применяют смеси с высоким содержанием воды, например, насыщенный водой вторичный бутанол, верхнюю фазу смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1: 5), систему изопропанол - аммиак, уксусную кислоту 15 % и т.п.

Вещества средней гидрофильное™, которые экстрагируются из воды этилацетатом, но не экстрагируются бензолом, хроматографируют с помощью растворителей средней полярности, например бу- тилацетатом или хлороформом с небольшими добавками полярных веществ или воды.

Для разделения веществ, практически не растворимых в воде, обычно в качестве элюентов используют бензол или циклогексан.

Иногда для оценки свойств веществ анализируемой смеси проводят ее предварительное хроматографирование (обычно в системе бутилацетат - вода). В зависимости от установленных таким способом величин R/ анализируемых веществ далее выбирают либо более полярные, либо неполярные смеси.

Так же как в тонкослойной хроматографии, для детектирования отдельных компонентов хроматограммы обрабатывают соответствующими реактивами, при взаимодействии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Количественное определение производят путем визуального сравнения интенсивности окраски или флуоресценции пятен пробы и стандартов, либо путем измерения размера пятна, предварительно определив зависимость между количеством вещества и размером его пятна на хроматограмме. Также возможно извлечение веществ из хроматографических пятен с последующим их физико-химическим анализом.

Вместо пластинок с нанесенным тонким слоем сорбента можно использовать специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок. Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижной фазе и быть однородной по плотности; имеют значение структура молекул целлюлозы в бумаге, ориентация волокон и другие свойства, влияющие на скорость движения подвижной фазы. Основные операции в бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной.

Для разделения водорастворимых веществ, например, неорганических ионов, в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве неподвижной – воду (бумагу заранее смачивают водой). Для разделения компонентов, хорошо растворимых в органических растворителях, гидрофильную бумагу превращают в гидрофобную, пропитывая ее растворами органических веществ (парафина, растительного масла и др.), а в качестве подвижной фазы используют воду, водный раствор какой-либо кислоты или щелочи, буферный раствор.

Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с бумаги. Индивидуальные растворители используются достаточно редко. Чаще для этой цели применяют смеси веществ, например, бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и др.

По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоретическую . Для получения двумерных хроматограмм хроматографирование проводят дважды: после обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси. Специфическим приемом является сочетание БХ и электрофореза. Для этого к влажному листу хроматографической бумаги прикладывают постоянное электрическое напряжение. Дополнительное воздействие электрического поля приводит к более четкому разделению, особенно для ионов с разными зарядами. Электрофорез можно проводить одновременно с хроматографированием, а также до или после хроматографирования.

Качественный состав пробы в методе бумажной распределительной хроматографии так же, как и в ТСХ, может быть установлен или по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме, или по численному значению R f каждого компонента. Количественные определения в БХ выполняются по хроматографическим характеристикам (по площади пятна на хроматограмме и интенсивности его окраски) или после вымывания подходящим физико-химическим методом. Отметим, что метод бумажной хроматографии, предложенный в 1941 г. Мартином и Синджем, в настоящее время используют в аналитических лабораториях довольно редко.

Вопросы для самоконтроля

Каковы преимущества двумерной хроматографии перед одномерной бумажной или ТСХ?

Как идентифицировать пятна органических соединений в методе ТСХ?

Как выполняют количественный анализ в методе ТСХ?

Как определяют R f в методе БХ и ТСХ? От чего зависит величина R f и какие условия нужно поддерживать постоянными при проведении эксперимента?

Как можно определить концентрации компонентов смеси после разделения методом БХ или ТСХ?

Как выполняется качественный анализ с помощью плоскостных вариантов хроматографии – БХ и ТСХ?

Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в бумажной хроматографии?

Почему в методе ТСХ необходимо герметически закрывать камеру с растворителем и пластинкой во время подъема фронта растворителя?

Как обнаруживают и идентифицируют компоненты на бумажных и тонкослойных хроматограммах?

Каковы области применения, достоинства и недостатки тонкослойной хроматографии?

Бумажная хроматография. Из первого слова вам понятно, что это нечто связанное с бумагой; а второе слово «хроматография» означает «цвет» (хрома) и «писать» (графия). Сложите их, и вы получите «писать цветом на бумаге» .

Бумажная хроматография является важнейшим тестом в науке. Тщательно проанализировав состав химического вещества по цвету, ученый может легко установить исходные вещества. Легко понять, что хроматография, действительно достойная изучения, работает именно за счет капиллярного эффекта – способа, которым вода распространяется в бумаге.

Колонка - содержит хроматографический сорбент, выполняет функцию разделения смеси на индивидуальные компоненты. Элюент - подвижная фаза: газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид. Неподвижная фаза - твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, в адсорбционной хроматографии - сорбент. Хроматограмма - результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени. Детектор - устройство для регистрации концентрации компонентов смеси на выходе из колонки. Хроматограф - прибор для проведения хроматографии.

Нисходящая хроматография Метод, при котором подвижная фаза движется вниз Восходящая хроматография Метод, при котором подвижная фаза движется вверх Горизонтальная хроматография Метод, при котором подвижная фаза движется горизонтально Круговая хроматография Метод, при котором подвижная фаза движется из середины круга к его окружности Проточная хроматография Метод, при котором продвижение подвижной фазы продолжается и после достижения фронтом конца бумаги Повторная хроматография Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму высушивают и хроматографирование повторяют (иногда несколько раз) Проявление Способ обнаружения веществ на хроматограмме Носитель Хроматографическая бумага

Неподвижная (стационарная) фаза Фаза, закрепленная на носителе Подвижная (мобильная) фаза Фаза, обеспечивающая перемещение разделяемых веществ по носителю с неподвижной фазой Старт Место, на которое наносится испытуемая проба

В бумажной хроматографии используют специальные сорта бумаги, различающиеся по номерам, с возрастанием которых плотность бумаги увеличивается. Бумага удерживает в порах воду, которая и является неподвижной жидкой фазой. Раствор пробы наносят в виде капель на лист бумаги на некотором расстоянии от края. После испарения растворителя край листа помещают в герметическую камеру, содержащую проявитель - подвижную жидкую фазу (например, спирты, кетоны, фенолы, четырёххлористый углерод, хлороформ и другие их смеси, а также смеси с неорганическими растворителями). При этом происходит передвижение исходного пятна по току проявителя и разделение смеси на компоненты. Если вещества не окрашены, то хроматограмму проявляют, например, опрыскиванием раствором индикатора, рассматривают в ультрафиолетовых лучах и пр. Отношение расстояния Rf, пройденного пятном I, к расстоянию, пройденному фронтом проявителя m, при одинаковых условиях эксперимента является постоянной величиной; Rf для различных веществ отличаются по значению и могут быть использованы для идентификации соединений.

Классификация Бумажной хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить распределительную адсорбционную Нормальный (метод применяется для разделения липофильных веществ.) ионообменную обращённо фазную препаративную аналитическую

Количественные определения различных веществ в пятнах хроматограммы ведутся обычными аналитическими методами. Различают: одномерные, двумерные, круговые, колоночные и электрофоретические хроматограммы.

I. Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции отдельных компонентов анализируемой смеси соответствующими адсорбентами. При работе этим методом анализируемый раствор пропускают через колонку, заполненную мелкими зернами адсорбента. Применяют адсорбционную хроматографию для разделения неэлектролитов, паров и газов. II. Распределительная хроматография основана на использовании различия коэффициентов сорбируемости отдельных компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающимися жидкостями. Одна из жидкостей (неподвижная) находится в порах пористого вещества (носителя), а вторая (подвижная) представляет собой другой растворитель, не смешивающийся с первым.

Этот растворитель пропускают через колонку с небольшой скоростью. Различные величины коэффициентов распределения обеспечивают неодинаковую скорость движения и разделения компонентов смеси. Коэффициент распределения вещества между двумя несмешивающимися растворителями есть отношение концентрации вещества в подвижном растворителе к концентрации того же вещества в неподвижном растворителе: (К = Сподв/Снеподв).

Иногда в качестве носителя для неподвижного растворителя вместо колонки используют полоски или листы фильтровальной бумаги, не содержащей минеральных примесей. В этом случае каплю испытуемого раствора наносят на край полоски бумаги, которую подвешивают в закрытой камере, опустив ее край с нанесенной на нее каплей испытуемого раствора в сосуд подвижным растворителем (движителем), который, перемещаясь по бумаге, смачивает ее. При этом каждое содержащееся в анализируемой смеси вещество перемещается с присущей ему скоростью в том же направлении, что и движитель.

Особым видом распределительной хроматографии является газожидкостная хроматография (ГЖК). В качестве неподвижной фазы используют различные нелетучие жидкости, нанесенные на инертный твердый носитель; в качестве подвижной фазы газообразные азот, водород, гелий, двуокись углерода и др. Разделение смесей методом ГЖК осуществляется в колонках, представляющих собой трубки с внутренним диаметром 1 6 мм и длиной 1 5 м, заполненные инертным носителем, например диатомитом, пропитанным нелетучей жидкостью, или стальные и стеклянные капилляры диаметром 0, 2 0, 3 мм и длиной 25 100 м с жидкой фазой, нанесенной на стенки этих капилляров (капиллярная газожидкостная хроматография).

. Ионообменная хроматография основана на использовании ионообменных процессов, протекающих между подвижными ионами адсорбента и ионами электролита при пропускании раствора анализируемого вещества через колонку, заполненную ионообменным веществом (ионитом). Иониты представляют собой нерастворимые неорганические и органические высокомолекулярные соединения, содержащие активные (ионогенные) группы. Подвижные ионы этих групп способны при контакте с растворами электролитов обмениваться на катионы или анионы растворенного вещества. В качестве ионитов применяют окись алюминия (для хроматографии), пермутин, сульфоуголь и разнообразные ионообменные вещества ионообменные смолы. Иониты делят на катиониты, способные к катионному обмену (содержат активные группы: SO 3 H, COOH, OH); аниониты, способные к анионному обмену (активные группы: NH 2, =NH); амфолиты – ионообменные вещества, обладающие амфотерными свойствами.

IV. Осадочная хроматография основана на различной растворимости осадков, образуемых различными компонентами анализируемой смеси со специальными реактивами, нанесенными на высокодисперсное вещество. Анализируемые растворы пропускают через колонку, заполненную пористым веществом (носителем). Носитель пропитан реактивом осадителем, который образует с ионами раствора осадки, имеющие различную растворимость. Образовавшиеся осадки в зависимости от растворимости располагаются в определенной последовательности по высоте колонки.

V. Эксклюзионная (молекулярно ситовая) хроматография основана на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гельпроникающую (ГПХ), в которой элюент – неводный растворитель, и гель фильтрацию, где элюент – вода.

Внося в центр листка смоченной фильтровальной бумаги каплю смеси красных и синих чернил и аккуратно нанося по кап лям чистую воду, вы скоро получите точно такую же картинку. Внизу- кольцевая хроматограмма на бумаге слож ной смеси шести различных аминокислот,

прояв ленная четырьмя разными реактивами. Вверху справа- двухмерная хроматограмма еще более сложной смеси четырнадцати различных аминокис лот. Эта хроматограмма получена из одной капли раствора смеси кислот, нанесенной в точку, обозна ченную кружочком. Проявление велось поочередно в двух направлениях разными реактивами. Каждая метка пятно принадлежит одной аминокислоте. По окраске и положению пятна можно совершенно точно установить природу вещества. Вверху сле ва - хроматограмма обыкновенного чернильного пятна кляксы на промокательной бумаге.

Проявление хроматограмм Проявление компонентов на хроматограмме проводят одним из способов, приведенных ниже. Физические методы(Визуально, при дневном свете, отмечают на хроматограмме положение пятен цветных веществ. При наличии флуоресцирующих веществ проявление проводят в УФ свете.) Химические методы(Хроматограммы проявляют жидкими и газообразными проявителями, используя реакцию имеющихся на хроматограмме соединений с подходящим реагентом проявителем с образованием окрашенного или флуоресцирующего вещества. Жидкие проявители наносят пульверизатором или используют реагенты в аэрозольной упаковке, газообразные применяют, поместив хроматограмму в пары проявителя.)

Хроматограмму кладут горизонтально на лист фильтровальной бумаги или оставляют подвешенной на стеклянной палочке и опрыскивают как можно более мелкими каплями (туманом) проявителя всю площадь хроматограммы вначале с одной, а потом с другой стороны. При проявлении газообразным проявителем хроматограмму подвешивают в камере, в которую помещен летучий реагент (например, кристаллы йода), или на дне которой проявитель получают химическим путем (например, оксиды азота получают путем добавления твердого нитрита натрия к раствору соляной кислоты).

Биологические методы Хроматограммы проявляют, используя биологическую активность хроматографируемых веществ. Качественная оценка хроматограммы заключается в определении положения пятна или полосы, которое характеризуется значением R f=a/b, где a расстояние от центра пятна пробы до стартовой линии, мм; b расстояние от фронта растворителя до стартовой линии, мм, или значением Rx: Rx= a/c, где c расстояние от центра пятна вещества сравнения до стартовой линии, мм.

Определение количества искомого компонента в пробе проводят путем сравнения размеров и интенсивности окраски его пятна с пятнами вещества сравнения, нанесенными на бумагу в интервале значений концентрации, указанных в нормативно технической документации на испытуемый реактив, и обработанными в условиях испытания. Оценку проводят визуально или с помощью аппаратуры (например, денситометра, устройства для сканирования пятен компонентов на бумаге), или путем элюирования пятен и последующего фотометрического определения оптической плотности растворов. Хроматограммы хранят в условиях, препятствующих появлению взаимных оттисков хроматограмм (например, с прокладками из фильтровальной бумаги). Если характер пятен позволяет, то на хроматограммы наносят слой быстросохнущего лака. В случае необходимости проводят зарисовку контура хроматограммы или фотографирование.

ПРИМЕРЫ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И СПОСОБОВ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Камера для восходящей и нисходящей хроматографии 1. Камера для восходящей и нисходящей хроматографии (Рис 1) Черт. 2. Камера для горизонтальной хроматографии (Рис2) (Рис2)1 камера; 2 решетка из стеклянных палочек; 3 стеклянная палочка для прижатия конца хроматограммы; 4 крышка; 5 хроматограмма; 6 растворитель

Черт. 3. Камера для круговой хроматограммы (две чашки Петри) (Рис 3) 1 бумажный фитиль; 2, 4 чашки Петри; 3 круговая хроматограмма; 5 растворитель Черт. 4. Способы расположения хроматограммы при восходящей хроматографии (Рис 4) 1 хроматограмма; 2 хроматографическая камера; 3 растворитель

Черт. 5. Способ вкладывания бумажной хроматограммы в желобок 1 хроматограмма; 2 старт; 3 стеклянная палочка; 4 загнутая палочка для прижатия хроматограммы в желобке; 5 желобок

Двумерную хроматограмму получают разделением пятен одномерной хроматограммы другим проявителем в направлении, перпендикулярном первому ряду пятен. На круговой хроматограмме пятно, помещённое в центре листа, размывают по концентрическим окружностям. В колоночной бумажной хроматографии разделение проводят на бумажных дисках, плотно вставленных в цилиндрическую колонку. Для получения электрофоретических хроматограмм бумажный лист пропитывают электролитом, закрепляют между электродами, наносят анализируемую смесь, подключают электроды к источнику постоянного тока и одновременно на бумагу подают подвижный растворитель в направлении, перпендикулярном направлению силовых линий электрического тока.

В этом методе разделение компонентов происходит вследствие их неодинакового распределения между двумя жидкими фазами и разной скорости перемещения веществ под действием электрического поля. Бумажную хроматографию используют для разделения и анализа неорганических и органических веществ в природных и промышленных материалах (например, определяют смолы в нефтепродуктах, редкоземельные элементы в горных породах и минералах).

Хроматографические методы незаменимы в контроле качества пищевых продуктов. Пищевую ценность продуктов определяют, анализируя аминокислотный состав белков, изомерный состав жирных кислот и глицеридов в жирах, углеводы, органические кислоты и витамины. В последние годы многие из этих анализов выполняются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для оценки безопасности продуктов в них выявляют пищевые добавки (консерванты, антиоксиданты, подслащивающие вещества, красители и др.), определяют свежесть продуктов, устанавливают ранние стадии порчи и допустимые сроки хранения.

В пищевых продуктах методами хроматографии можно обнаружить такие загрязняющие вещества, как пестициды, нитрозамины, микотоксины (афлатоксины, охратоксин А, зеараленон и др.), полиядерные ароматические соединения, биогенные амины, нитраты и др. Загрязнение пищевых продуктов возможно и вследствие проникновения вредных веществ из материалов упаковки, в частности, хлористого винила, бензола, пластификаторов и др. В мясных продуктах определяют анаболитические стероиды, гормоны и другие типы фармацевтических препаратов, злоупотребление которыми характерно для интенсивного животноводства. Отдельная область применения газовой хроматографии анализ состава аромата пищевых продуктов. Обнаружены тысячи летучих компонентов, из которых лишь несколько десятков определяют характер запаха, остальные придают запаху и вкусу продукта индивидуальность.

В последние годы возникло новое направление энантиоселективный анализ компонентов пищи. По соотношению оптических изомеров аминокислот, оксикислот и некоторых иных соединений можно однозначно установить, является ли данный продукт натуральным или содержит синтетические имитаторы и добавки. Энантиомерный анализ показал, что микроволновая обработка пищевых продуктов, в отличие от жесткой термической, не приводит к рацемизации аминокислот. Однако все молочные продукты, подвергнутые процессам брожения, содержат немало (нетоксичных) D аланина и D аспарагиновой кислоты продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий.

В природных жирах преобладают цис изомеры жирных кислот. Недавно обнаружено, что транс изомеры повышают содержание липопротеинов низкой плотности и уменьшают концентрацию липопротеинов высокой плотности в крови, что может способствовать развитию атеросклероза. Разработка методики газохроматографического разделения и анализа всех изомеров жирных кислот заставила производителей в несколько раз снизить содержание транс изомеров ненасыщенных кислот в маргарине.

Методом газовой хроматографии в некоторых сырах выявлено много нежелательных физиологически активных биогенных аминов, и эти сорта сыра были запрещены. В Японии в пищевых продуктах используется L триптофан, полученный с помощью генной инженерии и биотехнологии. И когда у тысяч людей обнаружили неизвестное ранее заболевание и десятки заболевших умерли, хроматографическими методами было установлено, что эти трагические последствия вызваны наличием токсичных загрязнений в триптофане (выявлено 60 примесей). Газохроматографическому анализу подвергаются вина, коньяки и другая спиртосодержащая продукция.

Теперь опять вернемся к фальшивому сливочному маслу. Есть такое масло - «Крестьянское» . С виду - масло как масло. Пахнет как сливочное. Вкусное. Для начала решено было проверить сколько в нем триглицеридов. В настоящем масле триглицеридов от массы всех липидов - большинство. В среднем - 98%. Для проверки применяем метод тонкослойной хроматографии. Используем пластинки Sorbfil. Хроматографическая система самая простая - бензол.

Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.

В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.

Виды хроматографической бумаги:

гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.

гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).

К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:

химическая чистота;

химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;

однородность по плотности;

одинаковая направленность волокон.

Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.

Для количественной оценки способности разделения веществ в хроматографической системе применяют коэффициент распределения К р – отношение концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах. Экспериментальное установление коэффициентов распределения в данном методе невозможно, для оценки способности разделения веществ на бумаге применяют коэффициент смещения (подвижности) R f . Коэффициент смещения равен отношению скорости движения вещества () к скорости движения подвижной фазы (
). Экспериментально величину R f находят как отношение расстояния Х, пройденного веществом, к расстоянию Х f , пройденному растворителем от старта до линии фронта:

.

Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.

Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:

визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;

измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.

Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.

Способы количественного анализа:

визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);

измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;

элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:

,

где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.

По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.

	Рис. 21. Камера для восходящей хроматографии: 1 – пробка; 2 – крючок; 3 – стеклянный сосуд; 4 – полоска бумаги; 5 – растворитель
	Рис. 22. Хроматографическая камера для нисходящей хроматографии: 1 – растворитель; 2 – перекладина для бумаги; 3 – полоска бумаги; 4 – стеклянный сосуд; 5 – стекающий растворитель
	Рис. 23. Разделение веществ методом круговой хроматографии: 1– хроматографическая бумага; 2 – крышка; 3 – чашка Петри; 4 – органический растворитель

Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.

Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.

Распределительная хроматография основана на свойстве разделяемых компонентов различно распределяться между двумя несмешивающимися или слабосмешивающимися жидкими фазами. Одна из жидких фаз является неподвижной фазой, она прочно удерживается на поверхности твердого вещества - «носитетеля» - в виде мономолекулярного слоя жидкости. В другой фазе - подвижной - растворяют исследуемую смесь, нанесенную на носитель.

В процессе хроматографирования происходит перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Скорость передвижения отдельных компонентов различна, что обусловливает возможность выделения их из сложной смеси. В практике исследований наиболее широко распространен метод распределительной хроматографии на бумаге.

Распределительная хроматография на бумаге. Носителем при служит воздушносухая фильтровальная бумага, а содержащаяся в ней гигроскопическая вода является неподвижной фазой. В качестве подвижной фазы применяют несмешивающиеся или частично смешивающиеся с водой органические растворители.

При получении хроматограмм по методу бумажной хроматографии на край полосы фильтровальной бумаги наносят каплю исследуемого раствора, затем полосу погружают в специально предназначенную для хроматографирования стеклянную ванночку, содержащую подвижный растворитель. При продвижении растворителя по бумаге отдельные компоненты смеси также перемещаются, но с различной скоростью, что обеспечивает разделение смеси.

Хроматограммы получают в герметических камерах в атмосфере, насыщенной парами органического растворителя и воды. Полученные хроматограммы высушивают и для проявления разделенных веществ опрыскивают (проявляют) реактивом, который образует окрашенные соединения с выделенными веществами, что позволяет определить расположение их на полосе бумаги. В определенных условиях опыта распределение отдельных веществ в обеих жидких фазах характеризуется постоянным коэффициентом Rf.

Коэффициент распределения Rf определяется отношением расстояния (в см), пройденного испытуемым раствором, к расстоянию (в см), пройденному растворителем. Воспроизводимость значений Rf зависит от условий проводимых исследований (качества бумаги, степени чистоты растворителей, температуры, состава газовой атмосферы и т.д.).

Различают несколько вариантов бумажной хроматографии: восходящая - растворитель движется снизу вверх, нисходящая - растворитель движется сверху вниз и радиальная (круговая) - растворитель движется от центра к окружности. Кроме того, применяют одномерную и двухмерную хроматографию; при одномерной хроматографии разделение веществ проводят в одном направлении, при двухмерной - в двух взаимно перпендикулярных направлениях.

Одномерная хроматография. Одномерная хроматография наиболее проста и применяется для исследования несложных смесей, для проверки чистоты вещества, для идентификации веществ.

При одномерной хроматографии методика определения заключается в следующем. На полосу хроматографической бумаги на расстоянии нескольких сантиметров от края наносят определенное количество исследуемого раствора. Бумагу помещают в ванночку с растворителем, находящуюся в камере, используя методику восходящей или нисходящей хроматографии (рис. 11). Растворитель при этом продвигается и, когда до конца остается примерно 2 см, процесс прекращают, хроматограмму вынимают из камеры, отмечают фронт растворителя и высушивают при температуре 100° С для удаления растворителя.

Хроматограмму проявляют обработкой специальным реактивом и по расположению образовавшихся цветных пятен на хроматограмме устанавливают Rf для определенного вещества, учитывая расстояние от исходной точки нанесения раствора до середины соответствующего пятна. Затем по специальным таблицам можно определить, какому веществу (например, какой аминокислоте) соответствует пятно. Обычно для идентификации веществ используют одновременно полученную хроматограмму известных веществ - «свидетелей». По совпадению расположения пятен этих хроматограмм устанавливают идентичность веществ.

Двухмерная хроматография. Двухмерную хроматографию применяют для разделения сложных смесей, например для характеристики аминокислот, получаемых при гидролизе белков. Этот хроматографический метод заключается в том, что разделение веществ проводят в два приема, двумя растворителями во взаимно перпендикулярных направлениях.

Радиальная (круговая) хроматография. Для радиальной хроматографии применяют круглые фильтры, которые делят простым карандашом на ряд одинаковых по размеру секторов и проводят две окружности - одну на расстоянии 1 - 1,5 см от центра и вторую на расстоянии 5 см. На линию первой окружности (стартовой) в каждом секторе наносят капли исследуемого раствора, а вторая окружность является границей хроматограммы. В центре бумажного диска делают отверстие, вставляют бумажный фитиль, который погружают в растворитель.

Поднимаясь по бумажному фитилю, растворитель переходит на бумажный диск и, распространяясь по бумаге, переносит компоненты, находящиеся в капле, от центра к окружности. В качестве камер применяют чашки Петри с высокими бортами. Радиальная хроматография является наиболее простым и быстрым методом хроматографического разделения веществ. При этом методе достигается высокий эффект разделения.

При количественном анализе методом бумажной хроматографии на бумагу наносят определенный объем исследуемого раствора. Если анализируют растворы с небольшой концентрацией исследуемых веществ, то капли наносят несколько раз, каждый раз подсушивая нанесенное пятно, затем проводят хроматографическое разделение.

Для количественного определения выделенных веществ пользуются следующим приемом. Из полученной хроматограммы вырезают участок, содержащий выделенное вещество, элюируют его растворителем и определяют его концентрацию при помощи спектрофотометра или фотоэлектроколориметра.